Khảo sát tinh dầu Sa nhân hai hoa (Amomum biflorum Jack.)

Vì vậy trong những năm gần đây, việc đầu tư nghiên cứu để phát triển, bảo vệ nguồn gen đa dạng của các loài thực vật chứa và có khả năng khai thác tinh dầu ở nước ta đang được đẩy mạnh hơn. Đề tài nghiên cứu “Khảo sát tinh dầu Sa nhân hai hoa (Amomum biflorum Jack.)” được thực hiện cùng với tiêu chí trên. Ở Việt Nam nhiều loài trong chi Sa nhân (Amomum Roxb.) từ lâu đã được khai thác, gây trồng và sử dụng như một nguồn dược liệu quý với nhiều công dụng dược tính như: giảm đau, an thần, an thai, hạ huyết áp, trị sốt rét và một số bệnh đường hô hấp… hay dùng làm gia vị, chế rượu mùi. Tuy nhiên việc nghiên cứu cây Sa nhân hai hoa, về mặt hóa học và dược liệu vẫn còn hạn chế. Vì vậy để tìm hiểu sâu hơn về loài thực vật trên, chúng tôi bước đầu khảo sát về sinh học, hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây Sa nhân hai hoa phân bố ở Lâm trường Tân Phú. Chúng tôi hy vọng nghiên cứu này sẽ giúp hiểu rõ thêm về một loài thực vật có tiềm năng khai thác tinh dầu và triển vọng ứng dụng trong dược liệu như cây Sa nhân hai hoa. Từ đó góp phần vào việc khai thác hữu hiệu nhiều nguồn tài nguyên thực vật còn bị bỏ quên ở Việt Nam.

Phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất

Nguyên liệu: Sa nhân hai hoa mọc hoang được thu tại Lâm trường Tân Phú, huyện Định Quán và phân khu Mã Đà thuộc khu dự trữ sinh quyển Vĩnh Cửu, huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai. Mẫu được tách riêng lá, thân khí sinh, căn hành và rễ. Chưng cất trong thời gian sớm nhất. Nếu lượng mẫu nhiều thì tách riêng từng bộ phận bảo quản trong tủ lạnh, khi cần dùng đem rửa sạch. Có thể để nguyên mẫu và ngâm căn hành trong nước nhằm giữ mẫu tươi trong thời gian ngắn.

Thiết bị, hóa chất: Thiết bị: bộ chưng cất Clevenger, cân điện tử, kính hiển vi, tủ sấy, microburet 10ml, tỷ trọng kế, khúc xạ kế, bộ dụng cụ đo nước tiểu: phễu, ống tube có vạch chia, ống tiêm và kim 16 G. Hóa chất: nước cất hai lần, ethanol tuyệt đối, sulphat natrium (Na2SO4) khan, phenolptalein, KOH 0,1N, HCl 0,1N.

Định danh thực vật

Định danh thực vật theo phương pháp đối chiếu, so sánh mẫu với các tài liệu mô tả về loài, dựa trên các đặc điểm hình thái của lá, hoa, quả; môi trường sống kết hợp với tên địa phương.

Xác định cấu trúc tiết tinh dầu

Giải phẫu các cơ quan thực vật bằng cách cắt ngang nhiều lát mỏng. Quan sát trạng thái sống trong nước bằng kính hiển vi ở các số bội giác khác nhau.

Ly trích tinh dầu

Nguyên liệu chủ yếu dùng cho các thí nghiệm khảo sát là lá. Các bộ phận khác như thân khí sinh, căn hành, rễ dùng cho việc đối chứng thêm. Nguyên liệu được cắt nhỏ và chưng cất thu tinh dầu theo phương pháp chưng cất nước cổ điển bằng bộ chưng cất Clevenger và định lượng theo phương pháp thể tích.

Xác định chỉ số vật lý và hóa học

Các chỉ số vật lý và hóa học được xác định theo tiêu chuẩn của AFNOR (1992).

Xác định thành phần hóa học tinh dầu

Mẫu tinh dầu được đem phân tích bằng máy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS HP-6890 tại Phòng phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM.

Khảo sát hoạt tính lợi tiểu

Khảo sát hoạt tính lợi tiểu của tinh dầu Sa nhân hai hoa trên đối tượng chuột nhắt trắng Mus musculus var albino với trọng lượng trung bình 25g/con. Cho chuột uống tinh dầu hòa tan trong dầu thực vật. Nhốt vào hệ thống đo nước tiểu. Quan sát và ghi nhận thể tích nước tiểu sau mỗi 15 phút, liên tiếp trong 3 giờ. So sánh thể tích nước tiểu giữa thí nghiệm thật và đối chứng, % thể tích nước tiểu ở mỗi thời điểm so với thời điểm 30 phút đầu tiên. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thí nghiệm đối chứng: chuột uống dầu thực vật.

Kết quả - Thảo luận

Điều tra cơ bản

Qua quá trình thu thập thông tin, thu được kết quả: Phần lớn mọi người biết Sa nhân hai hoa là cây dại ở rừng, mọc rải rác hay thành trảng ven suối, chân núi và thường được gọi là Riềng rừng. Ít người biết công dụng hay chỉ biết cây có thể làm thuốc nhưng không rõ có tác dụng. Có trong thành phần nồi xông giải cảm hay dùng nấu nước tắm cho phụ nữ mới sinh. Không ai biết cây có thể cho tinh dầu hay có giá trị kinh tế khác.

Định danh thực vật

Sau khi phân tích, đối chiếu, so sánh các đặc điểm hình thái của lá, hoa, quả…; đặc điểm sinh học và môi trường sống của cây với các tài liệu mô tả về loài. Đề nghị định danh mẫu cây thu được tại Lâm trường Tân Phú và phân khu Mã Đà như sau: Loài Amomum biflorum Jack; Thuộc chi Amomum Roxb.; Họ Zingiberaceae.

Hình 1. Cây Sa nhân hai hoa

Mô tả thực vật: Cây thân thảo, các bẹ lá dài xếp khít nhau tạo thành thân khí sinh cao từ 80-100cm. Căn hành dài mọc bò ngầm dưới đất, có vảy nâu, đường kính 3-4mm. Lá đơn mọc cách; phiến lá hình mũi giáo, mặt trên màu xanh đậm nhẵn, mặt dưới xanh nhạt có lông mịn; đỉnh lá có đuôi, mép lá nguyên có lông. Cụm hoa mọc từ căn hành với cuống mảnh có vẩy bao phủ màu hồng nhạt. Hoa 3-4 trên một cụm màu trắng ngà. Đài dạng ống màu trắng, chia ba thùy. Tràng dạng ống, màu trắng, trên chia ba thùy với thùy giữa lớn hơn hai thùy hai bên; cánh môi hình trứng ngược, màu trắng, giữa môi có hai vạch màu đỏ chạy từ gốc đến giữa cánh môi rồi chuyển sang màu vàng. Lá bắc ngoài hình bầu dục, lá bắc trong dạng ống. Cụm quả thường có từ 1-2 quả, hình cầu hay bầu dục, màu đỏ nâu phủ nhiều gai tù. Cây ra hoa vào cuối tháng 4, có quả vào tháng 6.

Hình 2. Hoa của Sa nhân hai hoa

Xác định cấu trúc tiết tinh dầu

Cắt ngang lá, thân khí sinh, căn hành và rễ thành nhiều lát mỏng, quan sát ở trạng thái sống dưới kính hiển vi ở các số bội giác khác nhau.

Xác định cấu trúc chứa tinh dầu là các tế bào tiết phân bố ở vùng vỏ đối với các bộ phận lá, căn hành và rễ. Riêng ở thân khí sinh, tế bào tiết còn tìm thấy ở vùng tủy.

Hình 3. Tế bào tiết ở thân khí sinh

Hình 4. Tế bào tiết ở lá

Hình 5. Tế bào tiết ở căn hành

Hình 6. Tế bào tiết ở rễ

Khảo sát thời gian ly trích

Điều kiện ly trích

Lượng nước sử dụng: Mẫu lá thu ở Lâm trường Tân Phú. Chưng cất với 3 lượng nước: 1200ml, 1300ml và 15000ml nước cất. Thời gian chưng cất tham khảo: 4 giờ. Kết quả: hiệu suất tinh dầu tăng khi lượng nước dùng chưng cất tăng và đạt hiệu suất cao nhất ở 1500ml nước (0,275%). Mức nước 1500ml sẽ dùng cho chưng cất nguyên liệu lá ở các thí nghiệm về sau.

Xử lý nguyên liệu: Lá thu tại Lâm trường Tân Phú. Cắt nhỏ hay xay. Chưng cất trong 4 giờ. Kết quả: nguyên liệu cắt nhỏ cho hiệu suất cao hơn khi xay nhuyễn (0,175% > 0,15%). Cách xử lý này được dùng cho các thí nghiệm sau.

Khảo sát thời gian ly trích

Lá thu ở Lâm trường Tân Phú. Chưng cất trong các khoảng thời gian 2-7 giờ. Kết quả: hiệu suất tinh dầu tăng khi thời gian ly trích tăng từ 2-3 giờ và cho hiệu suất tối ưu tại thời điểm 4 giờ (0,215%), tinh dầu màu vàng nhạt. Sau 5 giờ, hiệu suất bắt đầu giảm (0,185%  0,15%) và tinh dầu sậm màu vào thời điểm 7 giờ. Sự đổi màu này do nhiệt độ nước chưng trong ống gạn cao dẫn đến sự oxi hóa các cấu phần trong tinh dầu.

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu

Bộ phận ly trích

Lá, thân khí sinh, căn hành, rễ được dùng khảo sát. Thời gian chưng cất: 4 giờ cho lá và 5 giờ cho các bộ phận còn lại. Kết quả: lá cho hiệu suất tinh dầu cao nhất (0,275%), thân khí sinh thấp nhất (0,04%). Hiệu suất tinh dầu ở rễ cũng gần bằng lá nhưng lá dễ thu mẫu và thời gian xử lý nguyên liệu nhanh hơn. Sự khác nhau trên do số lượng và kích thước tế bào tiết ở các cơ quan không giống nhau.

Hình 7: Các tế bào tiết ở lá (x100) 

Hình 8: Các tế bào tiết ở thân (x40)

Thời điểm thu hái

Lá thu tại Lâm trường Tân Phú vào ngày 15 hàng tháng, từ tháng 3-6. Kết quả: hiệu suất tinh dầu cao nhất vào tháng 4 (0,3%), thấp nhất vào tháng 6 (0,175%). Do điều kiện thời tiết (lượng mưa, nhiệt độ, độ ẩm) khác nhau giữa các thời điểm thu hái đã tác động đến việc tạo tinh dầu.
c. Thời gian để héo: Lá để héo tự nhiên từ 0-52 giờ và sấy khô. Chưng cất trong 4 giờ. Kết quả: hiệu suất tinh dầu lúc đầu giảm sau đó ổn định trong thời gian dài (24 giờ) và sụt giảm nhanh từ thời điểm 44 giờ sau xử lý. Việc sấy khô nguyên liệu cho hiệu suất tinh dầu thấp hơn so với để héo tự nhiên. Vậy lá Sa nhân hai hoa có thể ly trích tinh dầu ngay sau khi thu hái hay bảo quản nơi thoáng mát để nguyên liệu khô tự nhiên. Thời gian để héo tối ưu là 44 giờ với hiệu suất 0,4774%.

Các chỉ số lý hóa của tinh dầu

Tinh dầu lá, thân, căn hành và rễ thu ở Tân Phú, ly trích theo phương pháp chưng cất nước cổ điển với thời gian tối ưu.

Bảng 1. Chỉ số vật lý tinh dầu Sa nhân hai hoa

Thành phần hóa học tinh dầu

Tinh dầu lá, thân, căn hành và rễ được xác định thành phần hóa học tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS). Kết quả: thành phần hóa học của tinh dầu các bộ phận khác nhau về cấu tử chính và hàm lượng của chúng. Tinh dầu lá và thân khí sinh có camphor là cấu tử chính, lần lượt có tỉ lệ 46,44% và 40,22%, ở rễ là fenchyl acetate (39,86%) và căn hành là 2-beta-pinene (26,83%). Có sự khác nhau khi so sánh hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu với nghiên cứu trước đây của Đào Lan Phương (1995). Nguyên nhân: do khác nhau về nguồn gốc nguyên liệu, thời điểm thu hái.

Hiệu suất tinh dầu ở các bộ phận cây trong khóa luận đều thấp hơn so với nghiên cứu của Đào Lan Phương. Tuy nhiên cả hai đều có lá và rễ cho hàm lượng tinh dầu cao nhất, thân khí sinh thấp nhất. Theo Đ.L. Phương thì thành phần chính ở tinh dầu lá, thân khí sinh và rễ đều là trans-p-(1-butenyl)anisole chiếm tỉ lệ rất cao, từ 90-94,7%, các hợp chất khác có tỉ lệ không đáng kể. Ngược lại, tinh dầu của đề tài không có sự hiện diện của chất này, trong khi các cấu phần chiếm tỉ lệ nhỏ hay chỉ ở dạng vết ở trên đóng vai trò cấu tử chính như camphor ở lá và thân khí sinh (46,44%, 40,22%), fenchyl acetate ở rễ (39,86%).

So sánh hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu theo khu vực phân bố

So sánh hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu lá, thân, căn hành và rễ khi thu mẫu nguyên liệu ở Lâm trường Tân Phú và phân khu Mã Đà. Kết quả: hiệu suất tinh dầu ở lá, thân khí sinh và rễ ở Tân Phú cao hơn Mã Đà, trừ rễ. Thành phần tinh dầu ở 2 điểm thu mẫu có sự khác nhau về cấu tử chính và tỉ lệ. Nguyên nhân: do khác nhau về điều kiện sống. Ở Tân Phú, cây phân bố dưới tán rừng thưa, đất có tầng thảm mục dày và ẩm, phù hợp đặc tính sinh trưởng của loài. Tại Mã Đà, cây mọc ở vùng đất trống chịu ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, đất khô cằn, tầng thảm mục mỏng, các yếu tố trên không thuận lợi để cây sinh trưởng và phát triển tốt như ở Tân Phú.

Bảng 2. Thành phần hóa học của tinh dầu các bộ phận cây Sa nhân hai hoa tại Tân Phú (TP) và Mã Đà (MĐ)

Cấu tử	Phần trăm (%)
	Lá		Thân khí sinh		Căn hành		Rễ
	TP	MĐ	TP	MĐ	TP	MĐ	TP	MĐ
camphene	9,43	13,58	-	7,05	-	13,86	19,59	13,37
beta-terpinene	15,52	-	-	-	-	8,95	-	-
1,8-cineole	14,99	-	-	-	-	-	20,20	-
2-beta-pinene	-	-	14,99	-	26,83	-	-	-
eucalyptol	-	-	11,99	-	16,09	-	-	-
camphor	46,44	38,37	40,22	62,46	10,59	31,70	-	-
fenchyl acetate	-	-	-	-	17,41	6,84	39,86	45,54

9. Khảo sát hoạt tính lợi tiểu của tinh dầu

Hoạt tính lợi tiểu của tinh dầu lá khảo sát trên chuột nhắt trắng trong 3 giờ. Thực hiện trên thí nghiệm thật: chuột uống tinh dầu pha và đối chứng: uống dầu thực vật. Kết quả: có sự khác biệt rõ giữa lượng nước tiểu ở lô đối chứng và thí nghiệm. Nhưng do đề tài chỉ mới thử nghiệm ở số lượng nhỏ chuột nên không có ý nghĩa thống kê (phần mềm xử lý số liệu Stagraphic 7.0) đối với kết quả hàm lượng nước tiểu tại mỗi thời điểm ở hai lô khảo sát. Đề nghị thử trên số lượng chuột nhiều hơn để nhận định rõ hơn về hoạt tính trên.

Kết luận

Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi xin đưa ra một số kết luận sau:

1. Cấu trúc tiết tinh dầu ở các bộ phận của cây Sa nhân hai hoa là tế bào tiết.

2. Tinh dầu Sa nhân hai hoa chủ yếu tập trung ở lá (0,275%) và rễ (0,267%), thân khí sinh cho tinh dầu không đáng kể (0,04 %).

3. Lượng nước dùng ly trích tinh dầu cho 80g lá cho hàm lượng tinh dầu tối ưu là 1500ml.

4. Nguyên liệu lá xử lý bằng cách cắt nhỏ cho hiệu suất tinh dầu cao hơn phương pháp xay.

5. Thời gian ly trích tinh dầu tối ưu cho nguyên liệu lá bằng phương pháp chưng cất hơi nước cổ điển là 4 giờ.

6. Thời điểm thu hái nguyên liệu lá đạt hiệu suất tinh dầu cao nhất vào tháng 4 (0,3%) trong khoảng thời gian khảo sát từ tháng 3 - tháng 6.

7. Hiệu suất tinh dầu lá tính theo trọng lượng sau xử lý (để héo) đạt giá trị cao nhất sau khi để héo 44 giờ (0,4774%).

8. Thành phần hóa học của tinh dầu các bộ phận cây Sa nhân hai hoa có sự khác nhau về cấu tử chính và hàm lượng của chúng. Ở tinh dầu lá và thân khí sinh có camphor là cấu tử chính, lần lượt có tỉ lệ 46,44% và 40,22%, ở rễ là fenchyl acetate (39,86%) và căn hành là 2-beta-pinene (26,83%).

9. Tinh dầu Sa nhân hai hoa thu tại Lâm trường Tân Phú và phân khu Mã Đà có sự khác nhau cả về thành phần hóa học và hiệu suất tinh dầu.

10. Tinh dầu lá Sa nhân hai hoa có tiềm năng giúp lợi tiểu ở chuột.

Tài liệu tham khảo

1. Baillon H., 1884: Traité de botanique médicale phanérogamique, Hachette et CIE, Paris, pp. 1433-1434.
2. Võ Văn Chi, 1999: Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB. Y học, tr. 61, 987, 1009, 1010, 1136, 1213.
3. Nguyen Xuan Dung, Tran Dinh Thang, 2005: Terpenoid & Application, Ha Noi National University, Viet Nam.
4. Phạm Hoàng Hộ, 2000: Cây cỏ Việt Nam, tập 3. NXB. Trẻ, Tp.HCM, tr.437.
5. Lã Đình Mỡi (Chủ biên), 2001: Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam, tập 2. NXB. Nông nghiệp Hà Nội, tr. 315-323.
6. Recueil de Normes Françaises, 1992: Hiules essentielles, Afnor, pp. 38-104
7. Lê Ngọc Thạch, 2003: Tinh dầu. NXB. Đại học Quốc gia Tp.HCM, 422 trang.
8. Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược liệu, 2002: Bài giảng Dược liệu, tập 2. NXB. Y học, Hà Nội, tr, 223-225.

Nguyễn Xuân Minh Ái, Đinh Bình Phương, Hoàng Việt
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM

(Tuyển tập báo cáo Hội nghị Sinh thái và Tài nguyên sinh vật lần thứ 3, 22/10/2009 - Viên ST&TNSV - Viện KH&VN Việt Nam)